激光共聚焦顯微鏡實(shí)現(xiàn)對樣品某一層的熒光信息進(jìn)行掃描的過程可以概括為以下幾個關(guān)鍵步驟:
光源準(zhǔn)備:
激光共聚焦顯微鏡采用激光束作為光源,通過照明針孔后形成點(diǎn)光源。
該點(diǎn)光源通過分束器進(jìn)入高數(shù)值孔徑顯微物鏡的成像系統(tǒng)。
樣品照射:
激光束經(jīng)物鏡聚焦于樣品上,對標(biāo)本焦平面上的每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。
樣品中如果存在可被激發(fā)的熒光物質(zhì),受到激光激發(fā)后會發(fā)出熒光。
熒光收集:
激發(fā)出的熒光與剩余的激光(如果波長不同)經(jīng)原入射光路反向回到分光鏡。
熒光通過探測針孔時先聚焦,然后被光電倍增管(PMT)或冷電耦器件(cCCD)等探測器接收。
成像與信號處理:
探測器接收到的熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號,并通過計算機(jī)進(jìn)行處理。
計算機(jī)軟件對電信號進(jìn)行分析和模擬,形成熒光圖像。
共聚焦原理:
照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的,這意味著焦平面上的點(diǎn)同時聚焦于照明針孔和探測針孔。
焦平面以外的點(diǎn)不會在探測針孔處成像,因此得到的圖像是樣品的光學(xué)橫斷面,具有更高的清晰度和對比度。
深度掃描:
通過控制調(diào)焦深度,激光共聚焦顯微鏡可以獲得樣品不同深度層次的圖像。
這使得科研人員能夠選擇性地掃描和觀察樣品的某一層熒光信息。
圖像輸出與存儲:
處理后的熒光圖像可以在計算機(jī)顯示器上顯示,并可以保存為數(shù)字文件,方便后續(xù)分析和共享。
總之,激光共聚焦顯微鏡通過其獨(dú)特的光學(xué)設(shè)計和工作原理,能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品某一層的熒光信息進(jìn)行精確掃描和成像,為科研人員在生物、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了強(qiáng)有力的工具。