激光共聚焦顯微鏡樣品制備的注意事項主要包括以下幾個方面：

一、樣品選擇與準備

樣品類型：樣品可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養(yǎng)細胞。對于懸浮細胞或懸浮粒子，應(yīng)使用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿承載樣品進行觀察。

樣品厚度：樣品的厚度應(yīng)適中，一般為1~2mm，以便于激光穿透和成像。

二、載玻片與蓋玻片的選擇與處理

質(zhì)量選擇：載玻片和蓋玻片應(yīng)選擇質(zhì)量好、光潔、無雜質(zhì)的。重要實驗需提前檢查其光學(xué)特性，確保無熒光干擾。

厚度要求：蓋玻片的厚度應(yīng)小于0.17mm，載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間。這樣的厚度配置有助于獲得清晰的成像效果。

處理步驟：蓋玻片使用前需用玻璃洗液浸泡處理一天以上，鉻酸浸泡過夜，去離子水沖洗掉殘存的洗液后，再用無水乙醇浸泡待用。臨用前需在酒精燈上過火滅菌處理。

三、熒光染料的選擇與標記

染料選擇：由于激光共聚焦顯微鏡使用單一波長的激光作為光源，因此熒光染料的選擇應(yīng)根據(jù)激光器的波長來確定。如果在同一樣品中有多種熒光染料標記，應(yīng)確保它們的發(fā)射波長不重疊，以避免串色問題。

標記方法：樣品需經(jīng)熒光探針標記（可單標、雙標、三標），標記方法應(yīng)確保染料與樣品充分結(jié)合且不影響樣品的生理狀態(tài)。

四、樣品的固定與封片

固定方法：對于需要固定的樣品（如組織切片），應(yīng)采用適當(dāng)?shù)墓潭▌┻M行處理，以確保樣品形態(tài)的穩(wěn)定性和染色的均勻性。

封片處理：如果樣品只需觀察一次且不易淬滅熒光，可使用一定濃度的甘油混合物封膜。如果樣品需要放置一段時間并多次拍攝，應(yīng)使用抗熒光淬滅的封片劑以減少熒光信號的損失。固定樣品常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

五、其他注意事項

操作規(guī)范：在制備樣品過程中應(yīng)嚴格遵守操作規(guī)程，避免污染和損壞樣品。

安全防護：激光共聚焦顯微鏡中的激光發(fā)射管使用壽命有限且價格昂貴，因此在操作過程中應(yīng)注意保護激光管免受損壞。同時應(yīng)避免暴露在中等功率和高功率的激光輻射中，特別是不要注視激光束。

儀器管理：激光共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，其正常運轉(zhuǎn)離不開科學(xué)的日常管理。應(yīng)指定儀器負責(zé)人負責(zé)儀器的開關(guān)機、日常維護和狀態(tài)檢查等工作。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡樣品制備涉及多個方面的注意事項，包括樣品選擇與準備、載玻片與蓋玻片的選擇與處理、熒光染料的選擇與標記、樣品的固定與封片以及操作規(guī)范和安全防護等。只有嚴格遵守這些注意事項才能確保獲得高質(zhì)量的成像結(jié)果并保護儀器免受損壞。