由于熒光顯微鏡的低分辨率和靈敏度以及缺乏觀察病原體的超微結(jié)構(gòu)信息，宿主細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)病原體的成像變得復(fù)雜。在此，作者提出了一種新的方法來(lái)觀察這些病原體在感染過(guò)程中的情況，從而避免了這些問(wèn)題：通過(guò)對(duì)胞內(nèi)病原體鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行生物正交標(biāo)記，并通過(guò)使用這些生物正交組來(lái)引入與隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡兼容的熒光團(tuán)，并將其置于相關(guān)的光電子顯微鏡（CLEM）工作流程中，病原體可以在其宿主細(xì)胞環(huán)境鼠傷寒菌中成像，分辨率為20 nm。因此，-CLEM方法提供了一種了解這些病原體感染過(guò)程的新方法。

研究介紹（節(jié)選）

抗生素耐藥性的上升是全球健康的主要威脅之一。在這方面，一類(lèi)病原體被證明是特別麻煩的，這類(lèi)病原體是細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。它們通過(guò)在宿主細(xì)胞吞噬體中駐留和復(fù)制而阻礙免疫檢測(cè)。通過(guò)分泌操縱吞噬體成熟的因子，它們確保了它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的存活，盡管哺乳動(dòng)物宿主部署了大量的防御機(jī)制，因此，在細(xì)胞和分子水平上理解細(xì)菌-宿主相互作用是J其重要的。生物正交化學(xué)已被證明是研究這些宿主-病原體相互作用的一項(xiàng)重大突破性技術(shù)。然而，目前我們?cè)囉玫臉?biāo)記方法要么需要將對(duì)生物正交甲硫氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸類(lèi)似物具有特異性的突變tRNA/tRNA合成酶對(duì)引入病原體以實(shí)現(xiàn)所需基團(tuán)的摻入，要么具有低靈敏度。這就限制了它們僅用于那些技術(shù)可用于的細(xì)菌菌株。

在過(guò)去的幾年里，超分辨率成像技術(shù)蓬勃發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)的分辨率。作者在之前研究的基礎(chǔ)上，加入了超分辨率顯微鏡，這將有助于克服與病原體相關(guān)的障礙：隨機(jī)光學(xué)分辨率顯微鏡在實(shí)驗(yàn)中靈敏度和改進(jìn)的分辨率，使熒光信號(hào)的分辨率與TEM更接近，并提高檢測(cè)靈敏度，允許通過(guò)CLEM對(duì)遺傳未修飾的病原菌進(jìn)行成像。

研究結(jié)果（節(jié)選）

使用-CLEM進(jìn)行生命周期研究的一種病原體是鼠傷寒沙門(mén)氏菌（以下簡(jiǎn)稱(chēng)沙門(mén)氏菌）。鼠傷寒桿菌或沙門(mén)氏菌）。這是一種革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)病原體，通過(guò)攝取后分泌各種效應(yīng)蛋白來(lái)確保其在胞內(nèi)存活。它們調(diào)節(jié)細(xì)菌所駐留的吞噬體的成熟，以產(chǎn)生適合其生存和復(fù)制的寄生泡。為了將我們的-CLEM應(yīng)用于沙門(mén)氏菌的成像，我們首先評(píng)估了我們是否可以通過(guò)使用BONCAT將生物正交氨基酸類(lèi)似物摻入到足夠的水平，以允許在被吞噬細(xì)胞攝取后對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)組進(jìn)行ccHc檢測(cè)，而不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和感染性。

圖2 用Hpg-S處理的BM-DC 75 nm冷凍切片的超分辨率N--CLEM圖像。

鼠傷寒將BM-DC與Hpg-S孵育。用磷酸鹽緩沖液洗滌以除去未結(jié)合/未內(nèi)化的S.鼠傷寒將細(xì)胞固定并進(jìn)行Tokuya樣品制備，并冷凍切片成75 nm切片。在ccHc條件下（紅色），用Alexa-647-疊氮化物處理切片。左圖：Hpg-S超分辨率N-成像的示例A）1和B）2。鼠傷寒右圖：左側(cè)面板的超分辨率CLEM圖像。箭頭表示吞噬體外信號(hào)。比例尺：250 nm。

結(jié)果表明，熒光標(biāo)記Hpg-S的準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度均優(yōu)于對(duì)照組。圖像的鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染率明顯高于低分辨率共聚焦圖像。隨后通過(guò)電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)環(huán)境顯示沒(méi)有破壞吞噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)膜是完整的，并且相對(duì)于那些沒(méi)有通過(guò)分析的區(qū)域，在經(jīng)過(guò)成像的樣品區(qū)域之間沒(méi)有觀察到結(jié)構(gòu)變化。細(xì)胞器根據(jù)其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)外觀很容易識(shí)別。圖像的相關(guān)性表明生物正交信號(hào)主要在沙門(mén)氏菌或寄生液泡周?chē)睆郊s為10-20 nm的小結(jié)構(gòu)上。

這是D一個(gè)使用生物正交組的超分辨率隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（）-相關(guān)光電子顯微鏡（CLEM）及其在宿主-病原體相互作用研究中的應(yīng)用的例子，因此可以用來(lái)在空間上詳細(xì)的宿主環(huán)境中觀察非轉(zhuǎn)基因病原體。與作者的方法和以前報(bào)道的方法相比，的靈敏度甚至允許檢測(cè)細(xì)胞外蛋白產(chǎn)物。這開(kāi)啟了成像病原體的可能性，對(duì)于這些病原體，先前的生物正交非規(guī)范氨基酸標(biāo)記（BONCAT）方法是無(wú)效的。CLEM與BONCAT、tRNA/tRNA合成酶突變體或生物正交細(xì)胞壁標(biāo)記的組合將對(duì)研究這些病原體的體內(nèi)生命周期有價(jià)值。將這一技術(shù)應(yīng)用于生物正交化學(xué)已經(jīng)發(fā)生變革的其他領(lǐng)域，也將為這些領(lǐng)域增加一個(gè)額外的超微結(jié)構(gòu)維度。

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