哺乳動物的DNA復(fù)制是在許多復(fù)制起點開始的，這些復(fù)制起點聚集在整個基因組的數(shù)千個復(fù)制域（RD）中。然而，目前尚不清楚每個RD內(nèi)的復(fù)制起源是隨機激活還是優(yōu)先在某些染色質(zhì)特征附近激活。

一.研究介紹

為了了解單個人類細胞中的DNA復(fù)制是如何在亞RD水平上調(diào)節(jié)的，作者使用STORM以超高分辨率直接可視化和定量表征跨S期的單個復(fù)制點（RFi）的時空組織、形態(tài)和原位表觀遺傳特征，揭示了RFi傳播動力學的分級徑向模式。

結(jié)合模擬和生物信息學分析，指出了一種“CTCF組織的復(fù)制繁殖”（CoREP）模型，該模型表明早期S期亞RD水平復(fù)制激活的非隨機選擇機制，由CTCF有組織的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)為局部表觀遺傳環(huán)境在協(xié)調(diào)基因組DNA復(fù)制中的關(guān)鍵作用提供了重要的見解。

二.研究結(jié)果（節(jié)選）

在S期的特定階段，向細胞提供染料標記的dUTP或EdU，將這些類似物分子結(jié)合到分裂期中DNA中，用STORM對標記的RFi進行成像，揭示了點狀分布以及跨S期，STORM（20 nm） 提供的好的空間分辨率能夠?qū)Fi進行更準確的定量表征，特別是對于基于數(shù)十納米內(nèi)多色共定位分析的后續(xù)發(fā)現(xiàn)。

圖1. 跨S期RFi的STORM成像和定量表征

單個HeLa細胞核中RFi的常規(guī)和STORM圖像，在S期的五個不同階段（從左到右，每個階段有30分鐘的標記）。插圖（紅色框）顯示每個階段單個RFi 的放大代表性圖像。頂部的橙色條表示S期標記周期的相對時間位置。

為了研究以亞衍射JI限分辨率復(fù)制DNA的局部染色質(zhì)環(huán)境中的動態(tài)變化，作者使用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Cy3B原位共標記RFi和與各種表觀遺傳特征相關(guān)的七個關(guān)鍵核標記，并進行雙色STORM成像以量化它們的共定位。在這些標記中，已知CTCF通過形成染色質(zhì)環(huán)來調(diào)節(jié)3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，組蛋白修飾的H3K27ace和H3K4me3與轉(zhuǎn)錄活性染色質(zhì)相關(guān)，核層定位的層粘連蛋白 A/C主要與轉(zhuǎn)錄抑制的DNA 相關(guān)，而SUZ12構(gòu)成組蛋白H3的抑制復(fù)合物的一部分，增殖細胞核抗原（PCNA）是哺乳動物復(fù)制的重要組成部分，它與H2B一起作為陽性對照。

圖2. RFi相關(guān)表觀遺傳特征在S期原位的動力學

（A–G）RFi和七個關(guān)鍵核標志物之間的共定位分析揭示RFi在整個S期的不同局部染色質(zhì)狀態(tài)。在S期早期（頂部），中期（中間）和晚期（底部）開始時標記的新復(fù)制DNA（粉紅色）的細胞，隨后用針對每個標記物（綠色）的抗體進行免疫標記，并用雙色STORM成像。

為了探測單個RFi的空間組織和動力學，作者研究DNA復(fù)制在空間和時間上的傳播模式。為此，在S期三個不同階段的兩個連續(xù)30分鐘時間窗口內(nèi)用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Atto 550標記新復(fù)制的DNA，此外，核層中的層粘連蛋白A/C用第三種染料Atto 488。在標記細胞的多色STORM成像中，兩個時間窗口的相對空間分布揭示了RFi進展的獨特時空模式。

圖3. S期早期和晚期的RFi表現(xiàn)出相反的傳播動力學時空模式

30分鐘窗口（紫色和綠色）內(nèi)新復(fù)制的DNA（紫色：第Y個窗口;綠色：第E個窗口;白色：共定位RFi）與層粘連蛋白A/C（藍色）一起標記每個細胞的核邊界。頂部的紫色和綠色條表示S期標記周期的相對時間位置。插圖（編號為1到6）顯示放大區(qū)域（紅色框），顯示兩種顏色之間的正常對比度（頂部）和增強對比度（中），以獲得更好的可視化效果。

為了理解RFi傳播獨特模式背后的機制基礎(chǔ)，CTCF通過形成染色質(zhì)環(huán)在調(diào)節(jié)3D基因組結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的突出作用，作者使用RNA干擾物降低HeLa細胞中的CTCF表達，使用免疫染色在蛋白質(zhì)水平上證實了這一點，結(jié)果表明，CTCF及其介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)是RFi形態(tài)和傳播動力學的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

圖4. CTCF調(diào)節(jié)RFi形態(tài)和時空傳播動力學

（A）用非特異性對照（NC）或CTCF siRNA轉(zhuǎn)染的細胞核中S期早期RFi的STORM圖像。插圖（藍色）顯示了CTCF在RNA干擾下的成功下調(diào)。（D）在用NC或CTCF siRNA處理的細胞核的S期早期開始時，在兩個連續(xù)的30分鐘窗口（紫色和綠色）中標記的新復(fù)制DNA的雙色STORM圖像。

總之，作者的研究為進一步詢問DNA復(fù)制和其他相關(guān)核內(nèi)過程的時空組織和動力學鋪平了道路，為理解復(fù)制和轉(zhuǎn)錄之間的耦合提供了一個框架，因為轉(zhuǎn)錄活性啟動子周圍的開放染色質(zhì)可以促進附近復(fù)制起源的選擇，這可能反過來解釋轉(zhuǎn)錄活性基因傾向于早期復(fù)制的觀察結(jié)果。